Os arrays GeneChip® da Affymetrix permitem
a análise da expressão genética global em vários
organismos modelo. Para cada gene representado no array existem múltiplos
pares de sondas (e.g. 11 pares), escolhidos apartir do terminal 3´
da respectiva sequência do mRNA. Cada par consiste numa sonda perfect
match (PM- a sua sequência é perfeitamente complementar à
sequência alvo) e numa sonda mismatch (MM- a sua sequência é
idêntica à PM com excepção para uma única
base no centro do oligonucleótido que se encontra alterada), permitindo
desta forma a quantificação e subtração dos sinais
causados por hibridação cruzada. (Ilustração
do princípio do método).
A amostra (moléculas alvo) que se pretende analizar
no GeneChip® é preparada apartir de células
ou tecidos, de onde é isolado RNA total (ilustração
gráfica). Num primeiro passo, é obtido cDNA em cadeia dupla
contendo a sequência do promotor T7 no seu terminal 5´. Esta
região é depois usada para transcrição in vitro,
na qual nucleótidos marcados com biotina (biotina-ddUTP e biotina-ddCTP)
são incorporados, obtendo-se então cRNA. Este segundo passo
permite um aumento de aproximadamente 100x do material inicial possibilitando,
no caso do procedimento standard, partir de 5 µg de RNA total. No novo
procedimento em pequena escala os nucleótidos marcados com biotina
não são incorporados no cRNA no passo anteriormente descrito.
Em vez disso, o cRNA não marcado é usado para uma nova amplificação
de cDNA, seguida de transcrição in vitro com os nucleótidos
marcados com biotina. Neste novo procedimento, a quantidade de material inicial
necessário é cerca de 50 ng de RNA total, facilitando os estudos
onde este material é o factor limitante, como no caso da técnica
de microdissecação por captura laser, pequenas biopsias e
células separadas por citometria de fluxo. Em ambos os procedimentos,
o cRNA marcado é fragmentado (resultando daí moléculas
com um tamanho entre 35-200 bases) e hibridado ao GeneChip®
durante 16 horas. Contrariamente aos arrays de cDNA, as duas amostras que
se pretendem comparar não são hibridadas no mesmo array, mas
sim em GeneChip® arrays separadamente. Os fragmentos de cRNA
marcados com biotina são por sua vez marcados com um conjugado de
estreptavidina fluorescente e a intensidade da fluorescência para cada
sonda é medida com um scanner apropriado.
No primeiro passo de análise, os arrays são
normalizados para reduzir variações de origem não-biológica.
Depois, usando métodos estatísticos aplicados às intensidades
de fluorescência de todos os pares de sondas para cada gene no array,
é calculado um valor que traduz a abundância relativa de cada
transcrito. Adicionalmente, é calculado o grau de confiança
com que um determinado transcrito é detectado (presente) ou não
(ausente). Nas análises comparativas subsequentes, compara-se o valor
de expressão obtido para cada gene nas duas amostras, permitindo assim
identificar genes cuja expressão aumentou (ou diminuiu) e quantificar
essas alterações.